"神兽"又立新功——科学家用羊驼抗体研发出可治疗消化道肿瘤的新药
发布时间：2019-06-11
中国每年被确认的肿瘤患者大约是530万人，每年因为肿瘤死去的患者高达200万人，如此庞大的数量向我们说明了癌症的可怕，而在该数据中，食道癌、胃癌、结肠癌这三大消化道恶性肿瘤，占了病例中的50%。以胃癌为例，我国每年胃癌新发病例67.9万例，死亡病例49.8万例，全世界近一半新发胃癌患者和死亡病例在中国。而胰腺癌更是被称为“癌中之王”，是恶性程度最高的肿瘤之一，根据《柳叶刀》 杂志2016年的数据显示，全球每年有超过20万胰腺癌患者死亡。 美国癌症学会预计2018年美国胰腺癌新发病人数55440人，死亡44330人。国内从发病数来看，胰腺癌并不算特别高，在2014年的各大癌症发病数中排名第十，约为9.2万例，但胰腺癌居全国恶性肿瘤死亡第6位，2014年约有8.1万人因胰腺癌而死。
2016年的美国临床肿瘤学年会(ASCO)，一家名不见经传的德国生物技术公司Ganymed开发的针对CLDN18.2的治疗性单抗——IMAB362成为该届ASCO会议横空出世的一匹黑马，这个药物和化疗药联合使用，可以将部分胃癌病人的生存时间延长近一倍！而且IMAB362还获得了胰腺癌孤儿药地位。
自IMAB362 临床2期疗效报道后，其针对的CLDN18.2立即成为消化道肿瘤研究的热门靶点。CLDN18.2属于紧密连接蛋白Claudin家族，属四重跨膜蛋白。CLDN18.2仅在胃上皮细胞短暂表达，其它正常组织几乎没有表达。但是CLDN18.2在多种80%胃癌和60%胰腺癌中高表达，此外还在肺癌、食管癌和卵巢癌中过表达。但是针对CLDN18.2的抗体开发极其困难。CLDN18.2与CLDN18.1胞外区域相似度高，但表达分布部位不同，并且小鼠体内也有CLDN18.2的高表达。因此，除IMAB362外，尚未有第二个针对CLDN18.2的治疗性抗体报道。
而基于“神兽”羊驼开发的纳米抗体平台是一种全新的抗体制备技术。最早是由比利时科学家Hamers 等1993 年在《Nature》杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH, Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，也称为纳米抗体（nanobody, a single domain antibody）。纳米抗体具有高亲和力和高特异性的特点，而免疫原性（尽管非人源，但免疫原性很低）和毒性则非常低，且不像scFv那样容易聚集。并且，VHH具有更小的分子量，穿透性更好，便于识别肿瘤细胞/病毒表面更小、更隐蔽的膜蛋白结合位点。纳米抗体的单链特性还使其便于连接多个结构域，结合不同靶标上的不同位点，起到“集团作战”的效果。2018年12月，《Science》上又发表了一篇关于Nanobody的论文——来自美国Scripps研究所的科学家们利用羊驼抗体，开发出一种全新的流感治疗性疫苗。它有望将所有流感病毒类型给一网打尽！ 2018年9月3日欧盟委员会（EC）宣布批准Cablivi (caplacizumab)上市，用于治疗成年获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）患者。Cablivi是获得批准的第一款专门针对aTTP的疗法，也是第一款获得批准的纳米抗体疗法。如今，来自“神兽”的抗体又给我们带来了新的惊喜：道尔生物（Doer Biologics）的科学家成功筛选获得了抗CLDN18.2的高亲和力人源化纳米抗体，并在荷瘤小鼠体内显示了强大的抗肿瘤活性。这是已知国际上首个针对CLDN18.2的纳米抗体，将为胃癌、胰腺癌等肿瘤治疗提供了新的希望。
针对CLDN18.2靶点抗体筛选困难的问题，道尔生物（Doer Biologics）利用其建立的HTSNanobody技术，通过巧妙的免疫和筛选策略，成功获得了多个能够高亲和力结合CLDN18.2的nanobody序列。由于CLDN18.1和CLDN18.2同源性极高，仅在第一胞外域中存在8个氨基酸的差异，为减少筛选难度，设计构建了表达CLDN18.2突变体（mCLDN18.2）的重组细胞株作为免疫原，mCLDN18.2的第二胞外域替换成无关序列，并通过IMB362进行免疫荧光检测，证明mCLDN18.2维持了天然膜蛋白结构。
mCLDN18.2第二胞外域用无关序列替换、mCLDN18.2IMAB362免疫荧光检测
利用过表达mCLDN18.2的重组细胞直接对羊驼进行多轮免疫，从外周血单个核细胞(PBMC)中获取RNA，并构建了纳米抗体噬菌体展示文库，经多轮筛选和CLDN18.1细胞的差减，成功鉴定获得了多个特异性结合CLDN18.2的纳米抗体序列。
anti-CLDN18.2纳米抗体的筛选鉴定
对多条纳米抗体序列进行了FC融合表达并纯化，随后进行了细胞ELISA、细胞免疫荧光等检测，验证了抗体的特异性结合，并证明与CLDN18.1不存在交叉结合。
CLDN18.2纳米抗体的免疫荧光检测
通过对CLDN18.2过表达细胞进行的细胞ELISA检测，筛选到的抗体序列的亲和力和IMAB362相当。随后，抗体序列进行了人源化，人源化改造后的anti-CLDN18.2 nanobody维持了原有的高亲和力，细胞免疫荧光检测显示保持了特异性结合CLDN18.2的特性。
CLDN18.2纳米抗体的细胞ELISA检测
人源化CLDN18.2纳米抗体的免疫荧光检测
进一步，将anti-CLDN18.2 VHH结构与小鼠FC融合表达，并对人组织样本进行免疫组化染色，结果显示能特异性染色正常胃上皮细胞和胃癌细胞。
CLDN18.2纳米抗体对人组织切片的免疫组化检测
进一步进行体内抗肿瘤药效学研究。在接种CHO~CLDN18.2肿瘤细胞的裸鼠进行药效实验，用以DR30301为代表的anti-CLDN18.2纳米抗体进行抑瘤实验，选择IMAB362作为阳性药。随给药时间的延长DR30301与IMAB362抑瘤效果的差异逐渐明显，在给药第18天时DR30301给药组小鼠荷瘤体积显著低于阳性对照药IMAB362（#）。CLDN18.2纳米抗体对肿瘤生长的抑制作用如下图所示，在抑制CHO-CLDN18.2肿瘤细胞生长方面，DR30301相较于IMAB362更有优势。
CLDN18.2纳米抗体对肿瘤生长的抑制作用
基于CLDN18.2纳米抗体的结构优势，公司在既有的MultiBody®、AccuBody®等平台技术上进行了多个相关结构的抗体药物开发，包括ADCC增强治疗性抗体，T细胞双特异性抗体等，在初步的荷瘤鼠模型中均展示了较好的疗效。未来我们期待特异性靶向CLDN18.2纳米抗体能够在胃癌、胰腺癌等消化道肿瘤的治疗中带来更多的惊喜。
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