"神兽"又立新功——科学家用羊驼抗体研发出可治疗消化道肿瘤的新药

发布时间:2019-06-11

中国每年被确认的肿瘤患者大约是530万人,每年因为肿瘤死去的患者高达200万人,如此庞大的数量向我们说明了癌症的可怕,而在该数据中,食道癌、胃癌、结肠癌这三大消化道恶性肿瘤,占了病例中的50%。以胃癌为例,我国每年胃癌新发病例67.9万例,死亡病例49.8万例,全世界近一半新发胃癌患者和死亡病例在中国。而胰腺癌更是被称为“癌中之王”,是恶性程度最高的肿瘤之一,根据《柳叶刀》 杂志2016年的数据显示,全球每年有超过20万胰腺癌患者死亡。 美国癌症学会预计2018年美国胰腺癌新发病人数55440人,死亡44330人。国内从发病数来看,胰腺癌并不算特别高,在2014年的各大癌症发病数中排名第十,约为9.2万例,但胰腺癌居全国恶性肿瘤死亡第6位,2014年约有8.1万人因胰腺癌而死。

2016年的美国临床肿瘤学年会(ASCO),一家名不见经传的德国生物技术公司Ganymed开发的针对CLDN18.2的治疗性单抗——IMAB362成为该届ASCO会议横空出世的一匹黑马,这个药物和化疗药联合使用,可以将部分胃癌病人的生存时间延长近一倍!而且IMAB362还获得了胰腺癌孤儿药地位。

自IMAB362 临床2期疗效报道后,其针对的CLDN18.2立即成为消化道肿瘤研究的热门靶点。CLDN18.2属于紧密连接蛋白Claudin家族,属四重跨膜蛋白。CLDN18.2仅在胃上皮细胞短暂表达,其它正常组织几乎没有表达。但是CLDN18.2在多种80%胃癌和60%胰腺癌中高表达,此外还在肺癌、食管癌和卵巢癌中过表达。但是针对CLDN18.2的抗体开发极其困难。CLDN18.2与CLDN18.1胞外区域相似度高,但表达分布部位不同,并且小鼠体内也有CLDN18.2的高表达。因此,除IMAB362外,尚未有第二个针对CLDN18.2的治疗性抗体报道。

而基于“神兽”羊驼开发的纳米抗体平台是一种全新的抗体制备技术。最早是由比利时科学家Hamers 等1993 年在《Nature》杂志中首次报道,在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体,该抗体只包含一个重链可变区(VHH, Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)和两个常规的CH2与CH3区,并且单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,也称为纳米抗体(nanobody, a single domain antibody)。纳米抗体具有高亲和力和高特异性的特点,而免疫原性(尽管非人源,但免疫原性很低)和毒性则非常低,且不像scFv那样容易聚集。并且,VHH具有更小的分子量,穿透性更好,便于识别肿瘤细胞/病毒表面更小、更隐蔽的膜蛋白结合位点。纳米抗体的单链特性还使其便于连接多个结构域,结合不同靶标上的不同位点,起到“集团作战”的效果。2018年12月,《Science》上又发表了一篇关于Nanobody的论文——来自美国Scripps研究所的科学家们利用羊驼抗体,开发出一种全新的流感治疗性疫苗。它有望将所有流感病毒类型给一网打尽! 2018年9月3日欧盟委员会(EC)宣布批准Cablivi (caplacizumab)上市,用于治疗成年获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)患者。Cablivi是获得批准的第一款专门针对aTTP的疗法,也是第一款获得批准的纳米抗体疗法。如今,来自“神兽”的抗体又给我们带来了新的惊喜:道尔生物(Doer Biologics)的科学家成功筛选获得了抗CLDN18.2的高亲和力人源化纳米抗体,并在荷瘤小鼠体内显示了强大的抗肿瘤活性。这是已知国际上首个针对CLDN18.2的纳米抗体,将为胃癌、胰腺癌等肿瘤治疗提供了新的希望。


针对CLDN18.2靶点抗体筛选困难的问题,道尔生物(Doer Biologics)利用其建立的HTSNanobody技术,通过巧妙的免疫和筛选策略,成功获得了多个能够高亲和力结合CLDN18.2的nanobody序列。由于CLDN18.1和CLDN18.2同源性极高,仅在第一胞外域中存在8个氨基酸的差异,为减少筛选难度,设计构建了表达CLDN18.2突变体(mCLDN18.2)的重组细胞株作为免疫原,mCLDN18.2的第二胞外域替换成无关序列,并通过IMB362进行免疫荧光检测,证明mCLDN18.2维持了天然膜蛋白结构。

mCLDN18.2第二胞外域用无关序列替换、mCLDN18.2IMAB362免疫荧光检测

利用过表达mCLDN18.2的重组细胞直接对羊驼进行多轮免疫,从外周血单个核细胞(PBMC)中获取RNA,并构建了纳米抗体噬菌体展示文库,经多轮筛选和CLDN18.1细胞的差减,成功鉴定获得了多个特异性结合CLDN18.2的纳米抗体序列。

anti-CLDN18.2纳米抗体的筛选鉴定

对多条纳米抗体序列进行了FC融合表达并纯化,随后进行了细胞ELISA、细胞免疫荧光等检测,验证了抗体的特异性结合,并证明与CLDN18.1不存在交叉结合。


CLDN18.2纳米抗体的免疫荧光检测

通过对CLDN18.2过表达细胞进行的细胞ELISA检测,筛选到的抗体序列的亲和力和IMAB362相当。随后,抗体序列进行了人源化,人源化改造后的anti-CLDN18.2 nanobody维持了原有的高亲和力,细胞免疫荧光检测显示保持了特异性结合CLDN18.2的特性。

     

CLDN18.2纳米抗体的细胞ELISA检测

人源化CLDN18.2纳米抗体的免疫荧光检测

进一步,将anti-CLDN18.2 VHH结构与小鼠FC融合表达,并对人组织样本进行免疫组化染色,结果显示能特异性染色正常胃上皮细胞和胃癌细胞。

CLDN18.2纳米抗体对人组织切片的免疫组化检测

进一步进行体内抗肿瘤药效学研究。在接种CHO~CLDN18.2肿瘤细胞的裸鼠进行药效实验,用以DR30301为代表的anti-CLDN18.2纳米抗体进行抑瘤实验,选择IMAB362作为阳性药。随给药时间的延长DR30301与IMAB362抑瘤效果的差异逐渐明显,在给药第18天时DR30301给药组小鼠荷瘤体积显著低于阳性对照药IMAB362(#)。CLDN18.2纳米抗体对肿瘤生长的抑制作用如下图所示,在抑制CHO-CLDN18.2肿瘤细胞生长方面,DR30301相较于IMAB362更有优势。

CLDN18.2纳米抗体对肿瘤生长的抑制作用

基于CLDN18.2纳米抗体的结构优势,公司在既有的MultiBody®、AccuBody®等平台技术上进行了多个相关结构的抗体药物开发,包括ADCC增强治疗性抗体,T细胞双特异性抗体等,在初步的荷瘤鼠模型中均展示了较好的疗效。未来我们期待特异性靶向CLDN18.2纳米抗体能够在胃癌、胰腺癌等消化道肿瘤的治疗中带来更多的惊喜。



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